编译：微科盟小兵，编辑：微科盟居居、江舜尧。
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导读
全球气候模型预测，世界许多地区降水事件的频率和强度将增加。然而，生物圈-气候对降水增加(eP)的反馈仍不清楚。本文报告了一项评估eP单独或与其他气候变化驱动因素(如CO2升高(eCO2)、变暖和N沉降)结合的影响的研究。经过10年的eP处理后，土壤总碳(C)下降，而植物根系产量在eP处理2年后下降。为了解释这种不同步性，我们发现与几丁质和蛋白质降解相关的真菌基因的相对丰度增加，并且与噬菌体基因呈正相关，这表明C降解中存在潜在的病毒分流。此外，eP增加了微生物胁迫耐受基因的相对丰度，这些基因是应对环境胁迫所必需的。微生物对eP的响应在系统发育上是保守的。eP对土壤总碳、根系产量和微生物的影响受到eCO2的交互影响。综上所述，本研究证明由于微生物群落组成、功能特性、根系产量和土壤湿度的变化，长期eP会导致土壤C流失。本研究揭示了地中海型缺水生态系统中一个重要的、以前未知的生物圈-气候反馈，即eP如何通过微生物-植物-土壤相互作用导致土壤碳流失。
论文ID
原名：Long-term elevated precipitation induces grassland soil carbon loss via microbe-plant-soil interplay
译名：长期降水增加通过微生物-植物-土壤相互作用导致草地土壤碳流失
期刊：Global Change Biology
IF：11.6
发表时间：2023.6
通讯作者：杨云锋，周集中
通讯作者单位：清华大学环境学院；美国俄克拉荷马大学
DOI号：10.1111/gcb.16811
实验设计
结果
1 土壤和植物变量
在试验前期，试验开始的第2-9年，eP处理(降水增加)没有改变土壤总碳(图1a和表S2)。在试验后期，第10～14年，eP使土壤总碳下降4.2%(p < 0.001，图1A和表S2)，在第10、13、14年eP对土壤总碳的影响显著(p< 0.021，图S1B)。土壤总氮不受eP单独影响(图1b和表S2)。结果，eP显著降低了C:N比(p= 0.002，图1C和表S2)。处理对其他土壤变量的影响见补充文本A。
在整个第2-14年，地上净初级生产力(ANPP)从自然降水(aP)的591 g m-2 year-1增加到eP的632 g m-2 year-1(p = 0.018，图1d和表S2)。相比之下，BNPP从aP的463 g m-2 year-1下降到eP的401 g m-2 year-1(p< 0.001，图1d和表S2)。BNPP的下降抵消了ANPP的增加，导致eP处理的NPP保持不变(图1d)。然而，eP对ANPP和BNPP的影响随年份变化很大(图S1c，d)。在14年的观测中，只有2年ANPP显著增加(图S1c)，而BNPP在前2-5年显著下降14.9%-25.2%(p < 0.021，图S1d)。然而，BNPP的下降仅在第6-14年后期的3年中观察到(图S1d)。
降水×增温对土壤总碳的影响存在交互作用(p= 0.048，表S2)，在自然环境温度下，eP降低了土壤总碳，但当温度升高时，eP没有改变土壤总碳(图1E)。在第2-9年前期，土壤总碳不受eP单独或与其他全球变化因子联合变化的影响(表S2)。与此相反，在第10-14年后期，土壤总碳受到降水×CO2×增温的交互影响(p = 0.008，表S2)，当CO2或温度升高时，eP处理下的土壤总碳下降(图1f)。试验第14年测定了土壤CO2通量。土壤CO2通量受降水×CO2×N沉降的交互影响(p = 0.022，表S3)，在CO2浓度升高和自然环境N含量条件下，eP增加了CO2外排(图1g)。土壤总氮受降水×N沉降×增温的交互影响(p = 0.047，表S2)，eP仅在N沉降和环境温度下降低了土壤总氮(图1b)。BNPP和NPP受降水×CO2×增温的交互影响(p < 0.037，表S2)，在CO2和温度升高条件下，eP降低了BNPP(图1H)，在CO2升高和环境温度条件下，eP降低NPP(图1i)。
图1 试验开始后第2-14年，eP处理对土壤总碳、总氮、CO2排放和植物变量的影响。第2-9年为第一阶段，第10-14年为第二阶段，(a)土壤总碳；(b)土壤总N；(c)土壤C:N比。(d) ANPP、BNPP和NPP。由于没有测量第9年的BNPP，因此只显示第2-8年和第10-14年的数据。(e)不同增温处理下的土壤总碳。(f)不同CO2和增温处理下第10-14年第二阶段土壤总碳含量。(g)第14年土壤CO2外排。(h)不同CO2和增温处理下的BNPP。(i)不同CO2和增温处理下的NPP。给出了平均值和标准误。处理：aC，环境CO2；eC，CO2升高；aW，环境温度；eW，增温处理；aN，环境N含量；eN，N沉降处理。***p < 0.001，**p < 0.01、*p < 0.05，#p < 0.1。BNPP，地下NPP；NPP，净初级生产力。
2 微生物功能基因
为了探究长期eP处理下微生物群落的变化，我们使用试验第14年采集的土壤样品，利用功能基因阵列(GeoChip 4.6)分析了微生物功能潜力，并使用靶向扩增子测序分析了原核生物和真菌群落组成。微生物功能基因组成在aP和eP处理之间存在差异(p= 0.050，表S4)，但功能基因α-多样性保持相似(表S5)。降水×CO2对功能基因组成和α-多样性有交互影响(表S4和表S5)。在CO2升高条件下，功能基因α-多样性随eP升高而增加，而在环境CO2浓度条件下，功能基因α-多样性不受eP的影响(图S4)。
与果胶(pme)和纤维素(编码来自细菌的内切葡聚糖酶的基因)降解相关的基因相对丰度在eP处理中下降(p< 0.025，图2a)。与此相反，编码几丁质(内切几丁质酶)和蛋白质(天冬氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶)等富N化合物降解相关酶的真菌基因相对丰度增加了4.4%-18.1%(p< 0.025，图2a)。此外，eP处理下甲烷生成标记基因(mcrA)的相对丰度增加(p = 0.017)，而甲烷氧化基因mmoX和pmoA的相对丰度没有变化(图S5a)。降水×CO2对C降解基因有交互作用，但对甲烷循环基因无交互作用(材料S2)。值得注意的是，在CO2升高条件下，与降解富N化合物相关的基因相对丰度的增幅更大(图S6a)。综上所述，这些结果表明，eP显著改变了土壤微生物的C循环潜力，尤其是在CO2浓度升高条件下。
由于噬菌体在调节微生物C动态中起着重要作用，我们对样品中检测到的221个噬菌体基因进行了研究。在eP处理中，与病毒结构和复制相关的噬菌体基因的相对丰度增加了4.7%-9.5%(p < 0.040，图2b)，表明eP可能刺激噬菌体的生长。相比之下，在我们的样本中检测到的101个真核病毒基因的总丰度保持不变(图2b)。降水×CO2对噬菌体基因有交互作用(材料S2)，在CO2升高条件下，噬菌体基因丰度随eP增加而增加(图S6b)。
由于长期eP降低了土壤总碳，我们研究了微生物应激反应是否被激发。8个应激反应基因的相对丰度随eP显著增加(图2c)，包括与葡萄糖限制、氧限制、磷酸盐限制、氧化应激和sigma因子相关的基因(详见补充文本B)。降水×CO2对磷酸盐限制和sigma因子基因有交互作用(材料S2)，在CO2升高和环境温度条件下，其基因丰度随eP增加而增加(图S6c，d)。
图2 长期eP处理对C降解基因、病毒基因和应激反应基因的影响。(a)单个C降解基因的百分比变化。百分比变化表示相对丰度的效应大小，计算如下：% effect =100%×(eP-aP)/aP。(b)原核和真核病毒基因功能亚类的变化百分比。(c)单个应激反应基因的变化百分比。仅显示显著和稍显著变化的基因(经FDR校正，p <0.100)。误差棒表示标准误(n = 32)。***p < 0.001、**p < 0.01、*p < 0.05、#p < 0.1。
3 微生物分类组成
每个样本鉴定出4649-14940个原核ASV，以及719-1757个真菌ASVs(图S2)。它们的分类组成在eP和aP处理之间存在差异(p = 0.001)，但几乎不受降水和其他气候变化处理相互作用的影响(表S4)。eP和aP处理之间的分类学和系统发育α-多样性没有改变(表S5)。
对eP积极响应的细菌，即eP条件下增加的细菌ASVs聚类在拟杆菌门、γ变形菌门、α变形菌门的Sphingomonadales和酸杆菌门的Blastocatellales(图3和材料S3，详见补充文本C)。对eP消极响应的细菌，即eP条件下降低的细菌ASVs，聚类在放线菌门、疣微菌门、绿弯菌门、酸杆菌门的subgroup6和α变形菌门的Beijerinckiaceae(图3和材料S3)。对eP积极和消极响应的细菌在这些支系中的系统进化聚类深度比consenTRAIT分析零模型中预期的要大(p < 0.001，表1)，表明细菌群落对长期eP的响应在系统发育上是保守的。
图3 eP显著改变了细菌ASVs的系统发育树。内环颜色代表每个ASV的门。中环的颜色表示相对于aP，eP中每个ASV的log2倍数变化。外环显示每个ASV的平均相对丰度。彩色分支代表系统发育上的聚类(科和更高分类水平的分支)，橙色分支表示增加的类群，蓝-绿色分支表示减少的类群。
表1 consenTRAIT分析显示微生物对eP的响应的系统发育保守性。
对eP积极响应的真菌主要聚类在子囊菌门的Sordariomycetes和Eurotiales(图4和材料S4)。对eP消极响应的真菌主要聚类在子囊菌门的Archaeorhizomycetes、Onygenales、Helotiales、Orbiliales、Periconiaceae、Herpotrichiellaceae，以及担子菌门的Agaricales(图4和数据S4)。对eP消极响应的真菌在深根分支中是系统发育保守的(p = 0.003)，而对eP积极响应的真菌则不是，这表明显著系统发育保守性的缺失(表1)。
图4 eP显著改变了真菌ASVs的系统发育树。内环颜色代表每个ASV的门。中环的颜色表示相对于aP，eP中每个ASV的log2倍数变化。外环显示每个ASV的平均相对丰度。彩色分支代表系统发育上的聚类(科和更高分类水平的分支)，橙色分支表示增加的类群，蓝-绿色分支表示减少的类群。
4 塑造微生物群落组装的生态过程
微生物群落对eP的系统发育保守性响应表明，环境过滤这一确定性过程可能在eP下起重要作用。为了验证这一点，我们使用零模型分析估计了随机过程和确定性过程的相对重要性。降水×CO2对细菌群落随机比率存在交互作用(p = 0.004)，在CO2升高条件下，细菌群落随机比率随eP的升高而降低(p = 0.031)，但在环境CO2浓度条件下，细菌群落随机比率随eP的升高而保持不变(图5a)。相比之下，无论CO2条件如何，eP均降低了真菌群落的随机比率(图5b)，表现出更高的环境选择。
为了确定影响微生物群落组成的决定性因素，我们进行了Mantel检验，以检查环境变量和微生物eP响应菌之间的联系。eP积极响应真菌和eP消极响应细菌均与土壤湿度和土壤CO2通量有关(Mantel’s r = 0.149-0.203，p < 0.015，图5c)。相比之下，eP消极响应真菌和eP积极响应细菌与环境变量的相关性较小(详见补充文本D)。我们还研究了环境变量与应激反应基因之间的联系，发现应激反应基因与土壤总碳、总氮和凋落物生物量相关(Mantel’s r = 0.101-0.267，p < 0.050，图5c)。
图5 影响微生物群落的随机和确定性因素。(a)估计原核生物群落组装的随机比率。通过PERMANOVA检验各处理效果的显著性。P：降水，C：CO2。采用t检验检验了不同CO2浓度下eP处理的显著性。(b)估计真菌群落组装的随机比率。(c) eP处理显著改变了驱动ASV组成变化的环境变量和应激基因。颜色梯度表示环境变量两两相关的Pearson相关系数。边缘宽度对应Mantel相关系数，边缘颜色表示Mantel检验的统计显著性。SRoot，浅根生物量(0-15 cm)；FRoot，细根生物量(0-15 cm)；DRoot，深根生物量(15-30 cm)；TRoot，总根生物量；AG，一年生禾草生物量；AF，一年生非禾草生物量；PG，多年生禾草生物量；PF：多年生非禾草生物量；AGB，地上生物量；TC，土壤总碳；TN，土壤总氮；Soil T，土壤温度。
5 与土壤总碳有关的生物和非生物变量
由于土壤总碳随长期eP而减少，我们确定了可能是土壤总碳的主要驱动因素的生物和非生物变量。我们对相关性最小的土壤变量和植物变量子集进行了SEM分析(图S3)(模型选择的详细信息见第2节)。土壤总碳受土壤湿度的负向影响，而受细根生物量的正向影响(图6a)。土壤总碳与真菌群落组成显著相关，而真菌群落组成又与富N几丁质和蛋白质降解相关基因的相对丰度相关。噬菌体基因的相对丰度与C降解基因的相对丰度有很强的相关性，可能揭示了病毒分流在土壤C循环中的重要作用。总的来说，这些变量解释了土壤总碳含量变化的54%(图6a)。SEM和ABT分析显示，在所有测试的自变量中，土壤湿度、细根生物量和真菌群落组成在调节土壤总碳中发挥了重要作用(图6a，b)。土壤pH和富集的微生物C降解基因对土壤总碳的影响较小。这些结果表明，土壤、植物和微生物变量解释了土壤总碳动态的相似比例。
图6 调节土壤全碳含量的生物和非生物驱动因素。(a)结构方程模型(SEM)显示eP处理(灰色矩形)、环境变量和微生物特性对土壤总碳的影响。红色箭头表示显著和稍显著的正向路径，蓝色箭头表示显著和稍显著的负向路径。每个箭头的宽度与关系的强度成正比，路径附近的数字表示标准化的路径系数。基于Bootstrap的路径系数p值：***p< 0.001、**p < 0.01、*p < 0.05、#p < 0.1。R2表示土壤总碳的方差解释比例。(b)基于SEM的标准化总效应(直接影响和间接影响)。(c) ABT分析揭示了生物和非生物变量对土壤总碳的相对影响。
讨论
了解长期气候变化如何影响土壤微生物群落和潜在的生态系统过程对于更好地预测陆地对气候变化的响应至关重要。通过研究14年eP对土壤变量、植物、细菌、真菌和病毒的影响，本研究提供了明确的证据，表明长期eP单独或与其他气候变化驱动因素联合，可以改变与土壤C流失相关的生态系统组成和功能特征。
1 长期eP处理改变了微生物群落组成和功能性状
尽管JRGCE短期或中期(3-8年) eP处理没有改变微生物群落组成，但是我们发现，经过14年的eP处理后，细菌和真菌群落组成发生了显著变化(表S4)。这一结果支持了我们的假设，即微生物群落在长期轨迹上继续变化，与短期反应不同。然而，这种差异也可以归因于技术差异。以往的研究依赖于基于脂质生物标志物分析的低分辨率微生物群落指纹图谱，可能无法揭示微生物群落组成的变化。我们的分析提供了支持性证据，表明微生物对水分供应的响应在系统发育上是聚类的，这可能反映了微生物生活史策略的根本差异，即驱动生存、生长和繁殖对环境条件的反应的特征。
微生物群落的系统发育保守可以归因于胁迫耐受性和竞争相关性状。为了支持更强的胁迫，eP处理降低了原核生物和真菌群落的随机比率(图5a，b)。此外，胁迫耐受基因的相对丰度随着长期eP而增加(图2c)，反映了较高的环境胁迫。例如，氧限制基因丰度的增加可能是由于土壤孔隙空间中的氧减少或在eP作用下在水膜中扩散，而当微生物受到胁迫时，氧化应激水平可能会增加。
与C降解相关的功能性状转向了富N化合物(如几丁质和蛋白质)的降解，而不是化学上富C化合物(如淀粉、果胶和半纤维素，图2a)的降解。这些结果与JRGCE之前的结果一致，即6年eP处理降低了降解淀粉、木聚糖和纤维素的水解酶活性，但与先前的几丁质水解酶活性降低的结果不一致。由于我们的结果反映了这些过程的遗传潜力，而酶活性反映了理想条件下的最大潜力，因此几丁质降解的差异可能是由于C降解特性在不同时间尺度上的变化或技术差异。富N分子(包括几丁质和蛋白质)的降解也随着从干旱到半干旱草原的降水梯度而增加，这可能反映了微生物获取氮养分的需求。
从微生物细胞中释放有机物的病毒分流在调节不同生态系统(如海洋和厌氧分解池)中的C和N循环中发挥着重要作用。同时，eP增加了噬菌体基因的相对丰度(图2b和图S5b)，并与几丁质和蛋白质降解相关基因呈正相关，进而影响土壤总碳(图6a)。这些结果表明，噬菌体可能在草原生态系统C循环中发挥了重要作用。然而，我们还不能确定噬菌体的宿主，这阻碍了对细菌和噬菌体之间相互作用的进一步研究。
2 长期eP处理效果受到CO2升高和增温的交互影响
在本研究中，CO2升高增强了eP对微生物功能性状和细菌群落组装的影响(图5a和图S6)。一种可能的解释是，根据多种资源限制(co)的生态框架，CO2施肥可能导致N和P等其他资源的短缺加剧。此外，eCO2和eP都能降低根系生物量，从而减少根系对土壤的投入，造成土壤养分限制。一致发现，eP与eCO2联合可以降低BNPP，甚至NPP(图1h，i)。本研究发现，当CO2浓度升高时，eP条件下富N化合物的降解增强(图S6a)，N循环减弱(图S7)，以及磷酸限制基因增加(图S6c)，这些发现支持N和P限制的观点(图S6c)。另一种可能是，eCO2降低了土壤蒸散量，延长了土壤水分保存时间，增加了土壤水分，正如在JRGCE和科罗拉多州半干旱矮草原草原中观察到的那样，从而增强了eP对微生物群落和生态系统功能的影响。限制
增温减轻了eP对土壤总碳的影响，以及降水×CO2对植物根系产量和磷酸盐限制基因的影响(图1e、i和图S6c)。这可能是因为在变暖条件下，蒸散量的增加会降低土壤的水分有效性和水分保持时间。同时，增温可以增强有机磷和氮矿化，改善养分限制，尽管在我们的研究地点尚未观察到N矿化速率因增温而增加。
3 微生物-植物-土壤相互作用介导eP引起的土壤碳流失
从试验第10年开始，eP处理降低了JRGCE的土壤总碳，在6年eP处理后，仅观察到土壤有机质(主要是根系物质)的游离轻组分减少，表明长期eP加剧了土壤C的流失。由于土壤无机C含量稳定的地区年平均降雨量大于600毫米，而在酸性或中性土壤中，水分有效性的增加对土壤无机C的影响很小，本研究中土壤总碳的减少可能主要归因于土壤有机C的减少。这一结果与北美大平原地区土壤有机C库随着降水增加而增加的结果相矛盾。一种可能的解释是，eP对土壤C的影响是由初级生产介导的。大平原地区降水的增加通过支持植物光合作用而导致土壤碳的增加，但eP处理并没有改变JRGCE的NPP，因为根系产量减少，抵消了地上部产量的增加(图1d)。根据最佳地上部-根C最优分配理论，随着土壤资源变得更有效，根系分配减少，根系产量可能会下降。另一种可能是由于eP处理中土壤偶尔淹水抑制了根呼吸。由于根系分泌物和分解的根系残留物是土壤C库的主要贡献者，因此根系产量的减少可能解释了本研究中观察到的土壤总碳的减少(图6)。值得注意的是，根系产量的下降仅在eP处理的前几年(第2-5年)是一致的，但在更长的时间内(第6-14年，图S1d)则不一致。根系产量和土壤C的不耦合下降(图S1)可能表明，根系生物量通过碳-团聚体和碳-矿物关联对土壤总碳含量产生了遗留效应。
微生物特性，如资源获取和胁迫耐受性，可以调节土壤C循环。本研究(图5c和6)和其他研究发现，在资源有限和非生物胁迫的环境中，微生物倾向于优先考虑投资于资源获取或胁迫耐受，而不是高生长产量，导致本研究中观察到的聚合物分解和土壤C流失。此外，eP条件下微生物对土壤C分解的增强可能是导致土壤C流失的原因。eP对异养呼吸有积极影响，尤其是在eCO2和环境N沉降条件下(图1f)。增加水分可用性可以刺激微生物活动、生长和呼吸，从而对土壤碳流失产生持久影响。此外，eP处理改变了微生物群落组成，这与微生物群落对不同C基质偏好的变化相一致。较高的真菌分类群(图4和数据S4)和C-降解基因丰度(图2a和图S8)表明，真菌在长期eP处理下对C的降解作用越来越重要，SEM和ABT分析支持了这一点(图6)。同样，本研究中观察到的eP积极响应真菌，Eurotiales和Sordaiales的丰度(图4和数据S4)与土壤有机C矿化速率呈正相关，而eP消极响应真菌Agaricales和Helotiales的丰度则与之呈负相关。真菌介导的C降解酶(如降解几丁质、磷酸二酯、木质素、纤维素和木聚糖的酶)的潜在活性与土壤湿度呈正相关。有趣的是，真菌群落组成对土壤C的调节作用与eP条件下C降解基因的富集以及噬菌体基因有关(图6a)，这意味着噬菌体、细菌和真菌之间可能存在复杂的相互作用，介导土壤碳周转对长期eP的反应。。
另外，通过土壤侵蚀或土壤C从陆地生态系统迁移到河流生态系统而发生的养分淋滤也会导致土壤C流失，尽管在本实验中，我们并不认为这是土壤C减少的主要原因。虽然我们没有直接测量C淋滤的强度，但由于土壤C淋滤和N淋滤经常同时发生，我们可以通过分析土壤N数据来估算。eP处理本身也没有改变N输入，因为补充水来自生活用水，是通过滴灌和高架洒水装置添加的，不会冲刷大气中的N。土壤总氮不会因eP而减少，除非N沉降升高且处于自然环境温度(图1b)，这表明只有在向土壤中添加更多N时，N淋滤才会明显。因此，与aP相比，淋滤的变化(如果有的话)可能在eP下对土壤C损失的影响较小。
4 意义和未来方向
本研究的结果对预测气候变化的生态后果具有重要意义。与短期效应不同，长期eP改变了微生物组成和功能性状。因此，长期气候变化对生态系统的影响是未来研究的关键。此外，本研究揭示了病毒分流在调节土壤C循环中的潜在作用，强调了将土壤病毒纳入微生物分析的重要性。尽管已有大量研究报道称eP增加了土壤C储量，但本研究结果表明，在这类水分有限的一年生草地上，长期eP与eCO2结合，通过微生物-植物-土壤相互作用，导致土壤C流失。因此，在一些地区，气候变化导致的降水和二氧化碳的长期增加可能会导致之前意想不到的土壤C流失。这可能是迄今为止被忽视的对气候变化的一个重要正反馈。然而，土壤C流失及其相关调控机制是否会在更长时间尺度上或在其他生态系统中持续存在，还需要进一步研究。