武汉协和医院麻醉姚尚龙教授与心外董念国教授团队合作研发并验证体外循环术后肺损伤的预警蛋白及网页预警模型
2023年9月，外科学知名学术期刊International Journal of Surgery（IF: 15.3，JCR：Q1）在线发表了华中科技大学同济医学院附属协和医院麻醉科，麻醉与危重病研究所（麻醉复苏教育部重点实验室）与华中科技大学同济医学院附属协和医院心脏外科合作，在体外循环术后肺损伤（CPB-ARDS）蛋白标志物精准预测领域的最新研究成果，题为“Early plasma proteomic biomarkers and prediction model of acute respiratory distress syndrome after cardiopulmonary bypass: a prospective nested cohort study”的论文。华中科技大学同济医学院附属协和医院麻醉科姚尚龙教授、林云教授，华中科技大学同济医学院附属协和医院心脏外科董念国教授为该研究共同通讯作者，华中科技大学同济医学院附属协和医院王宇，陈林，姚承烨博士为本研究共同第一作者。
研究意义
1. 首次鉴定了CPB-ARDS在术前及术后的血浆蛋白质组变化：本研究通过巢式队列研究设计及蛋白质组学检测方法首次发现CPB-ARDS术前及术后部分差异表达蛋白（DEPs），包括NPC2、TXNDC5、CTSL等，对CPB-ARDS具有预警作用，可作为候选预警蛋白质；并且术后DEPs富集分析主要与中性粒细胞介导免疫相关，提示其可能为CPB-ARDS早期响应的主要机制之一。
2. 首次开发了一个基于蛋白预警因素和临床预警因素的CPB-ARDS预警模型，经外部队列验证该模型预测性能良好：分别建立模型训练队列和验证队列，筛选临床预警因素，联合ELISA验证后的预警蛋白建立CPB-ARDS的列线图预警模型，应用于CPB-ARDS的个体化预测；开发网页版预警模型(
https://wy-wuhanunion.shinyapps.io/
CAPS_DynNomapp_WY/)并进行模型的内部验证，且在验证队列中对模型预测性能进行外部验证，首次得到一个预测性能良好的CPB-ARDS预警模型。
3. 首次在缺血再灌注肺损伤模型大鼠肺组织中验证预警蛋白质的表达：为了深入了解血浆预警蛋白在LIRI损伤中的作用以及肺组织中的蛋白质表达，通过左肺门钳夹术建立缺血再灌注肺损伤（LIRI）大鼠模型，通过肺组织蛋白质组学、免疫印迹法（WB）、免疫荧光法（IF）探索如上血浆预警蛋白在LIRI大鼠肺组织中的表达。
研究背景
ARDS是一种严重的呼吸系统疾病，最初定义为动脉血氧分压与吸入氧浓度（PaO2/FiO2）的比值小于200毫米汞柱[1]。2011年，该定义被修订为现在所称的“柏林定义”，标准包括：1）急性发作；2）双肺存在浸润模糊影；3）非心脏原因的呼吸衰竭；4）由PaO2/FiO2比率<300mmHg反映的氧合的显著损害[2]。自柏林定义发表以来的十年中，在ARDS的管理和研究方面的一些发展促使人们考虑扩大柏林定义。2023年，国际著名杂志Am J Respir Crit Care Med.发布了ARDS的全球新定义，对柏林ARDS定义进行了扩展，包括强调了脉搏血氧仪测血氧饱和度可代替动脉血气诊断ARDS，当胸片和/或CT不容易获得时，超声可用于成像，增加非插管ARDS等建议[3]。
对ARDS进行病因分类有助于更好的管理和治疗患者。ARDS可以分为直接性（肺炎、误吸、缺血再灌注）和间接性（非肺部感染型脓毒症、输血、胰腺炎），其中缺血再灌注肺损伤（LIRI）常见于临床,尤其是体外循环术后[4]。对于心脏大血管和瓣膜手术的病人，体外循环（CPB）是重要的辅助支持技术，可以在心脏停跳进行心内手术操作期间为机体供氧、供血。但是肺作为机体唯一接受全部心脏射血的脏器，对CPB引起的炎症及缺血再灌注反应十分敏感，术后容易发生ALI/ARDS[5, 6]。CPB后肺损伤是心脏手术后最常见的并发症，轻者仅一过性低氧血症症状，重者则表现为急性进展性ARDS[7]。由CPB-ARDS导致的肺功能不全，病死率高达50%~70%，是CPB术后死亡的主要原因之一[8]。
对于围术期ARDS，由于必要的手术操作，同时具有侵入性和创伤性，可能引起ARDS的刺激性损伤是已知的，这为研究ARDS的早期病理生理学改变和分子机制提供了机会。然而，CPB肺损伤的病理生理过程十分复杂，多因素，多系统，多通路共同参与，具体的发病机制尚未研究清楚。目前研究认为CPB-ARDS的主要促因是CPB相关的全身炎症反应以及肺部缺血再灌注反应[9-12]。因此，心脏CPB术后ARDS的发生机制复杂，必然涉及到多种蛋白质分子及信号通路，且发展过程中蛋白质标志物的表现是多样的、动态的。全面和深入的研究疾病的发生发展机制，需要在蛋白质组的层面上，对蛋白质分子进行系统的、动态的探索及分析[13-17]。并且，肺损伤发生发展早期判断指标有限，临床上也缺乏客观的蛋白质标志物指标，很少有研究对ALI/ARDS发病前或发病早期的生物标志物的预测价值开展相关研究。
蛋白质组学是对特定系统内蛋白质集合的研究，从不同生物样本中对全蛋白进行分析，消化成多肽，经液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）检测，根据检测到的质荷比鉴定蛋白的种类。蛋白质组学将疾病及药物研究引至前所未有的深度和广度，可以高通量的探索新的疾病标志物、探索疾病的发病机制[18]。蛋白质组学实验技术的出现使CPB-ARDS早期蛋白质组整体变化的研究成为可能。
综上，CPB-ARDS是一种发病率高，且预后差的严重临床综合征，研究其早期的蛋白质表达变化对CPB-ARDS的预警具有重要意义。目前针对高危手术后ARDS早期生物标志物的研究较少，尚无研究对心脏CPB术后ARDS的蛋白质组学及预警模型进行探索，值得在临床中进一步研究和验证。
研究设计
1. 蛋白质组学检测和机器学习初步筛选：研究将通过前瞻性巢式病例对照研究设计，建立心脏CPB手术患者队列，筛选和匹配CPB-ARDS和Non-ARDS患者；CPB心脏手术患者在CPB手术开始前的麻醉诱导后时刻（T1），CPB结束后即时（T2）和CPB结束后24小时（T3）采集3个血样。应用数据非依赖性采集（DIA）蛋白质组学，筛选CPB-ARDS患者外周血DEPs，进行功能富集的分析；并通过机器学习模型探索CPB-ARDS的候选预警蛋白质。
2. ELISA定量验证和联合预警模型建立及验证：建立新的心脏CPB手术患者队列，对候选预警蛋白的血浆表达浓度进行验证；并筛选临床预警因素，联合预警蛋白建立CPB-ARDS的列线图预警模型，应用于CPB-ARDS的个体化预测；在另一个新的队列中对该预警模型性能进行验证。
3. LIRI大鼠模型肺组织探索预警蛋白的作用及表达：通过左肺门钳夹术建立LIRI大鼠模型，通过肺组织蛋白质组学、WB、IF探索如上血浆预警蛋白在LIRI大鼠肺组织中的表达。
研究技术路线图如下：
研究结果
1. CPB-ARDS的DEPs谱及功能富集和PPI分析
CPB-ARDS组和Non-ARDS组各20例患者，围手术期3个时间点（T1，T2，T3），共120份血浆样本进行DIA蛋白质组学检测。在LC-MS/MS检测后，进行DIA-MS模式采集数据以构建用于蛋白质数据库搜索的肽库。LC-MS/MS检测共获得了6284个肽，并将这些肽映射到相应的蛋白质序列，获得709种人类蛋白质。通过Log2对数转换、归一化等处理后的蛋白质相对强度定量数据，通过FC和P value筛选（|log2（FC）| ＞ 0.263，P value＜0.05），分别在T1，T2，T3筛选出9个、29个、和35个DEPs。CPB术前（T1）两组间有差异的蛋白质较少，而从CPB结束后（T2）到术后24 h（T3），血浆中蛋白质开始发生较明显的变化，其中部分蛋白质可能作为CPB-ARDS早期的预警蛋白标志物，需要机器学习模型进一步筛选。为了解CPB手术损伤后发生明显上调或下调的血浆蛋白质的功能及在CPB-ARDS中的潜在作用，对T2和T3时刻的血浆DEPs进行功能富集分析，包括GO和KEGG分析。在T2和T3时刻DEPs的BP均富集到了中性粒细胞相关通路，包括中性粒细胞脱颗粒（GO:0043312）、中性粒细胞活化参与免疫应答（GO:0002283）、中性粒细胞介导的免疫（GO:0002446）。以上中性粒细胞相关通路在CPB后（T2、T3）均是DEPs富集的前5条重要BP条目，表明CPB-ARDS早期响应的蛋白质可能主要参与中性粒细胞相关的免疫损伤。术后DEPs富集分析主要与中性粒细胞介导免疫相关，提示其可能为CPB-ARDS早期响应的主要机制之一。
Figure 1. The DEPs among CPB-ARDS and Non-ARDS patients in Cohort 1. The volcano plot of protein expression in CPB-ARDS patients compared to Non-ARDS patients at T1 (A), T2 (B), and T3 (C); The top three GO and KEGG enriched items at T2 (D), and T3 (G); The PPI networks from Genemania database at T2 (E), and T3 (H); The PPI networks from String database at T2 (F), and T3 (I).
2. 基于机器学习模型的CPB-ARDS的候选预警蛋白质筛选
基于DIA蛋白质组学筛选的DEPs表达强度，建立术前（T1）、术后各时间点（T2、T3）的Lasso回归模型，初步筛选具有CPB-ARDS预警价值的蛋白质。Lasso回归的基础上建立Xgboost模型进一步对不同蛋白质变量的贡献度进行计算和排序，得出重要的DEPs，用于后续的预警蛋白质标志物验证，以及预测模型构建。重要性排序主要采用三种贡献度指标大小进行排序，包括信息熵gain，同时计算权重值weight和覆盖度cover，意味着相应的自变量的相对贡献大小。这三种贡献值的较高值意味着该蛋白质变量对于CPB-ARDS预测更为重要。采用ROC曲线下的面积AUC判断T1、T2、T3的Xgboost机器学习模型预测ARDS的区分度，采用混淆矩阵判断各个预测模型的准确度。Xgboost模型气泡图中，横坐标为信息熵gain，颜色条为覆盖度cover，点大小表示权重值weight，靠近右上角的变量为重要蛋白质。在T2时刻DEPs中，Xgboost模型选择了11个重要蛋白质，按gain值排序的重要预警蛋白质分别为NPC2、CD56、TXNDC5、CTSL、PLSI、CALR、ANGI、HPPD、MIME、SEPR、CD99。
Figure 2. The machine learning-based inference of biomarkers strongly altered at the end of CPB in Cohort 1. The XGBoost results for protein features at T2 (A); Receiver operating characteristic curve (B); Confusion matrix (C); The relative intensity of 11 protein features among Non-ARDS and CPB-ARDS groups a t T 2 ( D–N). ROC, receiver operating characteristic curve.
3. CPB-ARDS的候选预警蛋白质的表达验证
考虑在CPB术后尽早对CPB-ARDS进行风险预测，并且CPB结束即时（T2）的蛋白质标志物可能与CPB相关的肺损伤更相关，本研究拟选择T2的预警蛋白表达量进行定量验证和预警模型构建。Xgboost模型对T2时刻蛋白质组DEPs数据进行了重要性评分和排序，选择gain、weight、cover占比大于10%的蛋白质作为候选预警蛋白，在本部分研究的队列中进行ELISA定量检测，包括NPC2，CTSL，TXNDC5，CD56，差异具有统计学意义的蛋白质纳入后续的临床联合蛋白预警模型。CPB-ARDS组中的NPC2，CTSL，TXNDC5，CD56蛋白浓度中位数分别为1.779 ng/ml，0.230 ng/ml，2.202 ng/ml，121.448 ng/ml，Non-ARDS组中的NPC2，CTSL，TXNDC5，CD56蛋白浓度中位数分别为1.651 ng/ml，0.164 ng/ml，1.580 ng/ml，122.555 ng/ml。CPB-ARDS组和Non-ARDS组T2时刻血浆中的NPC2，CTSL，及TXNDC5浓度差异均具有统计学意义，CD56浓度差异无统计学意义。
为了进一步研究NPC2，CTSL，TXNDC5蛋白与CPB-ARDS的关联，采用Spearman相关性检验，分析表明了血浆TXNDC5、CTSL和NPC2浓度水平的变化与CPB术后最低PaO2/FiO2及术后插管时间有关。
Figure 3. ELISA analyses for the targeted proteins and the correlation of the protein concentration with values of a panel of clinical parameters in Cohort 2.The targeted protein concentration among CPB-ARDS and Non-ARDS patients for TXNDC5 (A), CTSL (B), NPC2 (C), and CD56 (D); The results of spearman correlation analyses of concentration of TXNDC5 (E), CTSL (F), NPC2 (G) and intubation retention time; The results of spearman correlation analyses of concentration of TXNDC5 (H), CTSL (I), NPC2 (J) and minimum PF ratio. PF ratio, PaO2/FiO2.
4. CPB-ARDS临床联合蛋白预警模型的建立及验证
经过蛋白质组学检测，机器学习模型筛选，以及独立队列的定量表达验证，T2时刻血浆表达的NPC2，CTSL，TXNDC5浓度将作为候选蛋白预警因素。经过如上初步差异检验，多临床变量逐步逻辑回归模型（SLR）筛选后，CPB时长与大量输血将作为候选临床预警因素。候选蛋白与临床预警因素共同纳入多变量SLR，构建临床联合蛋白预警模型，并绘制预警列线图。经过多变量SLR计算后，模型保留了NPC2，CTSL，TXNDC5，CPB时长，大量输血5种预警因子，构成了临床联合蛋白多因素预警模型。列线图在临床实际应用中可操作性较低，需要进行人工画线及手动计算得分值。因此本研究通过R语言的“DynNom”包及shinyapps.io注册，在网页上构建了一个动态列线图的操作界面(
https://wywuhanunion.shinyapps.io/CAPS_DynNomapp_WY/)，以网页计算器的方式一键计算CPB-ARDS的风险预测值。通过输入患者的临床预警因素的数值，以及蛋白预警因素的浓度，用户可直接得到CPB-ARDS的风险预测计算数值。
为进一步评价预警模型和防止过度拟合，采用3折、5折、10折交叉验证的方法进行内部验证。通过绘制ROC曲线及计算AUC判断联合预警模型对CPB-ARDS的区分度，如图所示，联合临床因素的预警模型的AUC较单纯临床因素预警模型更高（AUC=0.852 vs 0.767，P value=0.024）。根据两个预测模型的DCA曲线，基于两种预警模型在各个风险阈值获得的临床净效益均大于两条参考线的临床净效益（对所有患者采取干预的All参考线，或不对任何患者采取干预的None参考线），表示采用预警模型对心脏CPB手术患者的术后ARDS进行风险预测都可获得较好的临床净效益。但在各风险阈值范围，临床联合蛋白预警模型（红色曲线）的净效益基本大于传统的临床因素预警模型（黑色曲线），表示采用临床联合蛋白预警模型对高危患者进行干预获得的临床净效益更可观。除内部验证外，新的独立队列中，该模型的外部验证性能仍保持良好，AUC为0.820（95%CI:0.685–0.955），Brier评分为0.177（95%CI:0.147–0.206）。
Figure 4. Nomogram-based CAPS prediction model for CPB-ARDS. The nomogram of CAPS composed of clinical and protein factors at T2 in Cohort 2 (A). Draw a vertical line from the corresponding axis of each factor to the points axis to acquire the point of this factor. Make a summation of the points for each factor to yield a total score, and the probability of CPB-ARDS could be estimated by projecting the total score to the lower probability axis. The blue wavy line on each axis represented the data distribution of this factor; Receiver operating characteristic curve for the CAPS model and clinical factor model in Cohort 2 (B); Calibration plot of the CAPS model with a 1000 repetition bootstrap in Cohort 2 (C); Decision curve of the two prediction models showed the net benefit for the CAPS model was larger than that for the traditional clinical model (D); Clinical impact analysis curve of CAPS visually showed the number of people classified as positive (high-risk) by the model and the number of true positive people under each threshold probability (E); Receiver operating characteristic curve for the external validation of CAPS model in Cohort 3 (F); Calibration plot for the external validation of CAPS model in Cohort 3 (G). CPB time: cardiopulmonary bypass time; MRBC: massive transfusion of red blood cells; CAPS: the combined CPB-ARDS prediction score; ROC: receiver operating characteristic curve; 95% CI: 95% confidence interval.
5. LIRI后大鼠肺组织蛋白质组及预警蛋白的表达变化趋势
为了深入了解三种预警蛋白质在LIRI损伤中的作用以及肺组织中的蛋白质表达变化趋势，采用了LIRI大鼠模型及分子生物学检测方法。首先，将雄性SD大鼠随机分为四组，观察缺血再灌注后肺损伤的时间趋势。H&E染色显示再灌注2、6和24小时后的肺损伤程度在6h时间点最明显。此外，再灌注6小时后的肺损伤评分和炎症细胞数量更高，Occludin和ZO-1蛋白的下调以及Evans蓝的肺组织渗漏增多，表明再灌注6小时后血气屏障严重受损。
因此，研究团队对再灌注6小时后的LIRI组和假手术组大鼠肺组织样本进行了基于LC–MS/MS的蛋白质组学分析。在LIRI肺组织蛋白质组学结果中，CTSL和TXNDC5也显著上调。IF和WB分析显示，LIRI肺组织中CTSL和TXNDC5的失调与蛋白质组学数据一致。
以上结果表明如上预警蛋白可能也参与到LIRI发生发展的分子机制中。
Figure 5. The expression and function of the targeted protein predictors in LIRI rat model. The degree of lung injury after 2, 6, and 24 h of reperfusion, including the hematoxylin-eosin staining (A), lung injury score (B), the amount of inflammatory cells (C), and the expression of MPO (D); The immunoblot of Occludin and immunofluorescence of ZO-1 (E); The volcano plot of altered protein expression in lung tissue of LIRI rats (F); The GO and KEGG enriched items (G, H); The Immunoblot (I) and quantification of the signal of the protein expression of TXNDC5 (J), and CTSL (K) in the lung tissues; The immunofluorescence of the protein expression of TXNDC5 and CTSL (L) in the lung tissues. Each bar represents the Mean ± SD; ns: P ≥ 0.05; *P <0.05; **P< 0.01; ***P<0.001.
未来展望
该研究是为数不多的围术期肺损伤蛋白质组学研究之一，旨在检测ARDS的预警蛋白标志物，建立并验证CPB手术后ARDS的预测模型，实现围术期并发症的精准防控和分子机制探索研究。临床和蛋白质预测因子的联合使用可能在ARDS的早期治疗或预测中发挥重要作用。此外，TXNDC5和CTSL的早期上调可能与肺内皮和血管损伤有关，并为该综合征提供了潜在的治疗靶点。需要进一步的探索来阐明CPB-ARDS潜在的预测性生物标志物相互作用的相关机制。
参考文献
[1]Bernard G R, Artigas A, Brigham K L, et al. Report of the American-European Consensus conference on acute respiratory distress syndrome: definitions, mechanisms, relevant outcomes, and clinical trial coordination. Consensus Committee[J]. J Crit Care, 1994,9(1):72-81.
[2]Ranieri V M, Rubenfeld G D, Thompson B T, et al. Acute respiratory distress syndrome: the Berlin Definition[J]. JAMA, 2012,307(23):2526-2533.
[3]Matthay M A, Arabi Y, Arroliga A C, et al. A New Global Definition of Acute Respiratory Distress Syndrome[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2023.
[4]Matthay M A, Arabi Y M, Siegel E R, et al. Phenotypes and personalized medicine in the acute respiratory distress syndrome[J]. Intensive Care Med, 2020,46(12):2136-2152.
[5]郑坤, 张红. 体外循环肺损伤机制与肺保护策略的研究进展. 中国医药导报, 2016, 13(35): 32-35
[6]Laffey J G, Boylan J F, Cheng D C. The systemic inflammatory response to cardiac surgery: implications for the anesthesiologist[J]. Anesthesiology, 2002,97(1):215-252.
[7]高伟, 李文志. 体外循环肺损伤的保护性策略. 国际麻醉学与复苏杂志, 2019, 40(8): 6
[8]Apostolakis E E, Koletsis E N, Baikoussis N G, et al. Strategies to prevent intraoperative lung injury during cardiopulmonary bypass[J]. J Cardiothorac Surg, 2010,5:1.
[9]Chai P J, Williamson J A, Lodge A J, et al. Effects of ischemia on pulmonary dysfuncti